Tricine-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒
产品货号:15195
产品规格:30T/150T
产品简介:
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresisSDS-PAGE)原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶;非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开,主要用于分离蛋白质和寡核苷酸。常规 SDS-PAGE 凝胶电泳适用于分离大分子蛋白,对于小分子量的蛋白或多肽,分辨率大大降低。
尚宝生物 Tricine-SDS-PAGE电泳能够较好的分离10KD以下的蛋白或多肽,是电泳法分离多肽的主要方法,30T一般可以配制30~35块胶,具体配制的量应根据器具大小决定。电泳分离后可直接考马斯亮蓝染色、银染等。
产品组成:
名称 | 30T | 保存条件 |
试剂(A): 49.5%T 3%C | 20ml | 4℃ |
试剂(B): 49.5%T 6%C | 60ml | 4℃ |
试剂(C): Gel buffer | 90ml | 4℃ |
试剂(D): Glycerol | 20ml | 室温 |
试剂(E): Ammonium Persulfate | 0.3g | 室温 |
试剂(F): TEMED | 2×1ml | 4℃,避光 |
操作步骤(仅供参考):
1. 配制10%过硫酸铵(APS):直接在0.3g Ammonium Persulfate中加入3ml蒸馏水,充分溶解,分装成小份储存于-20℃或4℃。注意:一般用1.5mlEP管分装成0.5-1ml每支,-20℃保存,每支使用2-3次即弃用。短期使用时,可保存于4℃,1周有效。
2. 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度,按照附表配制分离胶:
①将不同体积的蒸馏水、49.5%T 6%C、Gel buffer、Glycerol加入到离心管中充分混合。
②加入10%APS和TEMED,立即涡旋混匀5~10s,以使溶液充分混匀。
③在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液(1mm mini-gel,分离胶溶液加约4ml),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1~3cm的水层,使凝胶表面保持平整。
④静置,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
3. 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度,按照附表配制夹层胶:
①去除覆盖在分离胶上的水层,用滤纸将残留的水尽量吸去。
②将不同体积的蒸馏水、49.5%T 3%C和Gel buffer加入到离心管中混合。
③加入10%APS和TEMED,立即涡旋混匀5~10s,以使溶液充分混匀。
④将适量的夹层胶溶液迅速加至分离胶的上面(对于1mm的mini-gel,夹层胶溶液加约1ml),然后在夹层胶溶液上轻轻覆盖一层1~2cm的水层,使凝胶表面保持平整。
⑤静置,待夹层胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
4. 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度,按照附表配制浓缩胶:
①去除覆盖在夹层胶上的水层,用滤纸将残留的水吸去。
②将不同体积的双蒸水、49.5%T 3%C和Gel buffer加入到离心管中混合。
③加入10%APS和TEMED,立即涡旋混匀5~10s,以使溶液充分混匀。
④将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
⑤静置,待凝胶聚合后,小心地拔出梳子,避免破坏加样孔。进行电泳操作。
5. 电泳
将电泳槽置于4℃或冰水浴中,外槽加入阳极缓冲液,内槽加入阴极缓冲液,30V预电泳10min,将处理好的样品加入点样孔,30V电泳1h,100V电泳至溴酚蓝到达胶底部后停止电泳,进行后续的考马斯亮蓝染色或电转。
附表 Tricine-SDS-PAGE 凝胶配方表
成份 | 分离胶 | 夹层胶 | 浓缩胶 |
浓度/体积 | 20%/4.5ml 16.5%/4.5ml 15.5%/4.5ml | 10%/2ml | 10%/2ml |
49.5%T 3%C | - - - | 0.407ml | 0.16ml |
49.5%T 6%C | 1.82ml 1.5ml 1.395ml | - | - |
Gel buffer | 1.5ml 1.5ml 1.5ml | 0.667ml | 0.496ml |
Glycerol | 0.48ml 0.48ml 0.48ml | - | - |
蒸馏水 | 0.7ml 1.02ml 1.125ml | 0.926ml | 1.344ml |
10%APS | 40μl 40μl 40μl | 20μl | 20μl |
TEMED | 5μl 5μl 5μl | 3μl | 3μl |
注意事项:
1. 过硫酸铵配制成10%APS溶液后应当-20℃保存,用2~3次,亦可4℃保存几天。
2. TEMED易挥发,使用后请盖紧瓶盖。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切。可通过适当调节TEMED 的用量,控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
3. 配制聚丙烯凝胶的过程中,如果室温较低,可以置于37℃放置,加速凝固。在液体混匀的时候应尽量避免气泡的产生。
4. 在分离胶上层加蒸馏水时要缓慢,速度不宜过快。
5. 49.5%T 3%C 和 49.5%T 6%C为不同比例的Acr-Bis,有轻微神经毒性,请小心操作。
有效期:6个月有效。