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蛋白酶K溶液的使用方法及注意事项说明

发布时间: 2022-01-19  点击次数: 94次
  蛋白酶K(Proteinase K),相对分子量约为29.3 kDa, 是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。可切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键,应用广泛,可用于制备脉冲电泳的染色体DNA,蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶等实验,蛋白酶K的一般工作浓度是50—100µg /ml。因蛋白酶K在变性剂如SDS(1%)中可提高其活性,所以在使用中,常根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH、温度等因素确定具体的工作浓度。蛋白酶K在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性。
 
  蛋白酶K有两个Ca2+结合位点,它们离酶的活性中心有一定距离,与催化机理并无直接关系。然而,如果从该酶中除去Ca2+,由于出现远程的结构变化,催化活性将丧失80%左右,但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染核酸制品的蛋白质。所以,蛋白酶k消化过程中通常也加入EDTA(以抑制依赖于mg2+的核酸酶的作用)。但是,如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白,如角蛋白一类,则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA(ph8.0)至终浓度为2mmol/l,以鳌合Ca2+。
 
  运输和储存
 
  冰袋运输,-20 ℃保存,可以保存12个月。避免反复冻融。
 
  使用方法
 
  1. 配制蛋白酶K溶液:一般以20mg/ml浓度配制蛋白酶K溶液。将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml dd水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml,然后分装成小份贮存于-20℃。
 
  2. 根据终浓度50—100µg /ml,吸取适量蛋白酶K溶液,到待消化样品中,孵育温度为55至65℃,理想孵育温度为58℃,孵育时间为15分钟至48小时;理想孵育时间为2小时。推荐反应缓冲液:50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
 
  注意事项
 
  蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的样品处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,能增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号。但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果。EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果。

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